Une nouvelle analyse quantitative ciblée de X

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 12856 (2023) Citer cet article

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Les analyses d'inactivation du chromosome X (XCI) aident souvent au diagnostic des traits liés à l'X, mais une évaluation précise reste difficile avec les méthodes actuelles. Nous avons développé une nouvelle stratégie utilisant l'enrichissement Cas9 sans amplification et le séquençage des technologies Oxford nanopore appelée XCI-ONT, pour étudier et quantifier rigoureusement le XCI dans le gène du récepteur aux androgènes humain (AR) et le gène humain de la rétinite pigmentaire liée à l'X (RP2). XCI-ONT mesure la méthylation sur 116 CpG dans AR et 58 CpG dans RP2, ainsi que des chromosomes X parentaux séparés sans biais PCR. Nous montrons l’utilité de la stratégie XCI-ONT par rapport à la technique XCI de référence basée sur la PCR, qui n’étudie qu’un ou deux CpG par gène. Les résultats mettent en évidence les limites de l’utilisation de la technique de référence lorsque le modèle XCI est partiellement asymétrique et les avantages de XCI-ONT pour quantifier rigoureusement XCI. Cette étude fournit une méthode XCI universelle sur l'ADN, qui est très précieuse dans le cadre clinique et de recherche sur les traits liés à l'X.

L'inactivation du chromosome X (XCI) est un mécanisme de compensation de la différence de nombre de chromosomes X entre les hommes (46XY), les femmes (46XX) et les individus atteints d'aneuploïdies X1. Le mécanisme moléculaire humain du XCI n'est pas complètement compris2,3, mais des études ont montré que le XCI est contrôlé par des facteurs agissant en cis et en trans dans le centre d'inactivation de l'X (Xic), y compris l'expression génique du transcrit spécifique inactif de l'X (XIST). et les gènes de transcription spécifique X-active (XACT)3. Cela conduit finalement à une expression monoallélique, à une accumulation de H3K27me33 et à une méthylation des sites CpG à proximité des promoteurs de gènes sur le chromosome X inactif (Xi) (Fig. 1A) 4,5,6. La méthylation s'est avérée importante pour le maintien de l'état inactif de Xi7,8,9,10. Le XCI chez l’homme est initié dès le stade précoce de l’implantation embryonnaire3, et le choix du chromosome X à inactiver est en général décrit comme un processus aléatoire, dans lequel les deux chromosomes X sont représentés de manière égale11,12. Cependant, il a été observé que l'inactivation préférentielle d'un chromosome X, appelée XCI asymétrique, modifie la manifestation de la maladie liée à l'X chez les femelles porteuses, ce qui indique que le génotype est important dans le choix du chromosome X actif (Xa), éventuellement en sélection cellulaire due à un désavantage de cellule mutante13,14,15,16. Premièrement, l’inactivation préférentielle de l’allèle pathogène a été associée à une survie sélective des femelles ou à un effet moins sévère des traits liés à l’X. Il a été démontré qu'une asymétrie extrême est un bon indicateur de la présence de variants pathogènes liés à l'X chez les femelles porteuses15,17,18 et les analyses XCI chez les membres de la famille aident donc souvent à l'interprétation des variants liés à l'X. Deuxièmement, l'expression de l'allèle pathogène peut conduire à la manifestation de phénotypes chez les femelles porteuses de traits liés à l'X19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 et peut expliquer les différences phénotypiques observées chez les femelles porteuses affectées et personnes atteintes d'aneuploïdies X21,24,29,30,31,32,33,34,35,36. Il convient de noter qu’il est recommandé d’effectuer des analyses XCI sur des tissus pertinents, à différents âges et chez des non-fumeurs37,38,39,40,41,42,43,44. En général, la définition de l'asymétrie a été > 80 :20, mais en raison des limites de la technique de référence utilisée pour l'analyse XCI, la quantification de l'asymétrie n'a pas été recommandée pour un silence autre que 100 :0, soulignant la nécessité d'une méthode quantitative. .

(A) Schéma du mécanisme d’inactivation du chromosome X et de son effet chez les femelles porteuses de traits liés à l’X. Bleu : chromosome X actif (Xa), rouge : chromosome X inactif (Xi), étoile jaune : variante pathogène liée à l'X. Illustrations créées à l'aide d'Adobe Illustrator 2022 (disponible sur https://adobe.com/products/illustrator). (B) Les méthodes XCI de référence utilisent des enzymes de restriction sensibles à la méthylation (HpaII) qui coupent le Xa mais laissent le Xi intact. HpaII cible respectivement deux et un site CpG dans le récepteur des androgènes (AR) et Retinis pigmentosa 2 (RP2), et est suivi d'une PCR et d'une analyse de la longueur des fragments (FLA) couvrant les régions répétitives polymorphes (CAGn ou GAAAn) qui séparent les allèles parentaux. Illustrations créées à l'aide d'Adobe Illustrator 2022 (disponibles sur https://adobe.com/products/illustrator). L'approche XCI-ONT coupe l'ADN indépendamment de l'état de méthylation en utilisant l'enrichissement CRISPR-Cas9 avec trois ARNg (roses) flanquant une région d'intérêt (ROI) d'environ 3 kb couvrant 116 sites CpG dans AR et 58 sites CpG dans RP2. (C) XCI-ONT comprend : (1) Déphosphorylation des extrémités 5' pour réduire la ligature des adaptateurs de séquençage aux brins non ciblés. (2) Le système CRISPR-Cas9 se lie et coupe le retour sur investissement, et l'ADN est à queue dA pour la ligature de l'adaptateur aux côtés coupés de Cas9, qui sont à la fois à queue 3' dA et phosphorylés en 5'. (3) La bibliothèque est séquencée à l'aide des appels de base Oxford Nanopore Technologies et Bonito. (4) Appeler des répétitions en alignant les lectures sur des génomes de référence contenant toutes les répétitions possibles dans les régions, et les lectures sont divisées en haplotypes en traçant le nombre de lectures avec différentes répétitions. Enfin, l’appel et la quantification de la méthylation sont effectués à l’aide de Nanopolish, et les données sont visualisées à l’aide d’Integrative Genomics Viewer (IGV). La méthylation moyenne du ROI est calculée et le rapport XCI entre les deux chromosomes X est déterminé.

80:20), often used in the interpretation of X-linked variants. In addition, quantification can be very useful when XCI is modifying disease e.g. in the investigation of carrier females presenting symptoms due to expression of the pathogenic allele (incomplete silencing). Approaches for quantifying the levels of XCI on the maternal and paternal allele have been proposed before but this requires either bisulfite conversion and PCR50 or paired RNA and DNA sequencing data of the XIST gene using informative transcribed heterozygous single nucleotide variants (SNVs) to separate the parental alleles41,51. A SNV is not as informative as repeated elements and can therefore not be used to distinguish between individuals. This highlights the need for a universal quantitative XCI analysis on DNA to be used for research applications and clinical diagnostics related to X-linked traits./p> T;p.(Arg1190Cys), NM_004606.4) where carrier females had ~ 100:0 skewed XCI when investigating the AR gene57. The XCI result was confirmed in this study by investigating the RP2 locus of two asymptomatic carrier females (IV:8, III:10) and one asymptomatic non-carrier female (III:7) (Supplementary Fig. 1). The two asymptomatic carrier females presented a ~ 100:0 skewed XCI status consistent with the maternal X-chromosome being silent (carrying the pathogenic variant). The asymptomatic non-carrier female had expression of both alleles i.e. a random XCI status, however the method presents variable result between experiments and contrasting results in the different genes (63:37 in AR vs. 47:53 in RP2). In addition, three females (female I, II and III) were investigated using the golden standard method. All individuals showed different ratios of XCI for both AR (female I 62:38, female II 47:53 and female III 81:19) and RP2 (female I 81:19, female II 60:40 and female III 87:13) (Table 1, Supplementary Fig. 2)./p> 80:20), often assisting in the interpretation of X-linked variants. In addition, quantification can be highly useful in the investigation of carrier females manifesting symptoms due to expression of the pathogenic allele. Quantification of XCI can illuminate the mechanism of disease, and provide useful information for improving prenatal risk assessment36, diagnostics and treatment development of X-linked traits. Lastly, we would like to illuminate the possibility that different disorders and pathogenic variants requires different levels of expression to develop symptoms and stress the use of a quantitative XCI investigation to answer these questions. A related application for XCI-ONT is monitoring pharmacological Xi reactivation, which has been suggested as treatment for X-linked disorders due to skewed XCI59,60,61,62./p> T;p.(Arg1190Cys) variant in the TAF1 gene (NM_004606.4)57. DNA from two carrier females (III:10, IV:8) and one non-carrier female (III:7) as well as three unrelated females (female I-III) was included in the current analysis./p> 20). The data were visualized by plotting the number of reads (y-axis) containing any repeat in the range of 5–40 repeats in AR or 5–30 repeats in RP2 (x-axis) (Supplementary Fig. 3). The reads were divided into haplotypes based on the repeat count and comparison with the golden standard results. Methylation calling and calculation of the methylation frequency was performed using Nanopolish software package (version 0.12.0). Only sites with a log-likelihood ratio > 2.5 (methylated) or < − 2.5 (unmethylated) were included in the methylation analysis (Supplementary Fig. 5). Bam-files were converted using the “converting bam for igv” package66 and the methylation status was visualized using Integrative Genomics Viewer bisulfite mode CG (version 2.10.0). The XCI status was established by using the average methylation frequency in the chrX:67543761–67546170 region (AR gene, 116 CpG sites, hg38) and chrX:46836539–46837273 region (RP2 gene, 58 CpG sites, hg38) followed by calculating the ratio of the average methylation between the alleles in each gene./p>

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